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体细胞变异

体细胞变异差不多就是在说肿瘤突变。常用的方法是测配对样本，就是组织样本和血液样本分别检测再call snp的时候一起放入软件中来找突变位点。也有靶向测序直接测肿瘤突变的位置。另外，目前有游离DNA检测来检测血浆中的肿瘤游离DNA，要求是超高深度的检测出肿瘤marker。还有测marker基因启动子甲基化来得到肿瘤早筛效果的方法。

GATK流程

先用配对的正常样本生成一个vcf，GATK对它的命名是PoN，也就是Panel of Normal 

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gatk Mutect2 \
    -R Homo_sapiens_assembly38.fasta \
    -I B17NC.final.bam \
    -tumor B17NC \
    --disable-read-filter MateOnSameContigOrNoMappedMateReadFilter \
    -O B17NC.vcf.gz

如果有多个正常样本PoN，可以这样合成。 

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gatk CreateSomaticPanelOfNormals \
    -vcfs 1.vcf.gz \
    -vcfs 2.vcf.gz \
    -vcfs 3.vcf.gz \
    -O all.vcf.gz

有了PoN之后，就可以和配对的肿瘤数据call somatic了，需要注意的是，这里的-tumor和-normal就是前面加头信息时加上去的（待确认）。 

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gatk Mutect2 \
    -R Homo_sapiens_assembly38.fasta \
    -I B1701.final.bam \
    -I B17NC.final.bam \
    -tumor B1701 \
    -normal B17NC \
    --germline-resource af-only-gnomad_grch38.vcf.gz \
    -O B1701.m2.vcf.gz

GATK后续还有些继续过滤校正去污染的方法，这里就不再继续了。更多的时候，我们只有单肿瘤样本的数据（tumor-only），还是可以用mutect2的。单肿瘤样本可以使用-pon参数来导入pon，gatk提供了hg38和b37的pon，不过貌似只能从google云下载。 

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gatk Mutect2 \
    -R Homo_sapiens_assembly38.fasta \
    -I B1701.final.bam \
    -tumor B1701 \
    --germline-resource af-only-gnomad_grch38.vcf.gz \
    -O B1701.m2.vcf.gz

在使用Mutect2后，进行FilterMutectCalls能有效过滤突变。

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gatk FilterMutectCalls \
    -R hg38.fa \
    -V B1701.m2.vcf.gz \
    -O B1701.m2.filter.vcf.gz

Varscan流程

Varscan的流程可以先用samtools的mpileup作为输入。 

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samtools mpileup -B -f Homo_sapiens_assembly38.fasta \
    -q 15 -d 10000 \
    B17NC.final.bam B1704.final.bam \
    | java -jar VarScan.jar somatic -mpileup \
    B1704 --strand-filter 1 --output-vcf

VarDict流程

Mutect2有时并不能获得低突变丰度的reads，可以使用VarDict，适合于ctDNA流程。

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VarDict -G hg38.fa \
    -f 0.001 -N sample \
    -b tumor.bam \
    -c 1 -S 2 -E 3 -g 4 target.bed \
    | teststrandbias.R \
    | var2vcf_valid.pl -N sample -E -f 0.001 > sample.vcf

使用pisces进行call snp/indel

pisces由illumina出品，运行速度十分不错。

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dotnet Pisces.dll \
    -b tumor.bam \
    -g hg38/ \
    -o output/ \
    -t 8 -i target.bed