Control-FREEC是一款广受好评的WGS、WES数据CNV检测软件。
安装
当前最新版本是v11.6（29 May 2020）。
下载源码编译安装
wget https://github.com/BoevaLab/FREEC/archive/refs/tags/v11.6.tar.gz
tar -zxvf v11.6.tar.gz
cd FREEC-11.6/src
make
获得编译后的freec执行程序。
如果需要统计GC比例，还需要安装gccount
wget http://bioinfo-out.curie.fr/projects/freec/src/gccount.tar.gz
tar -zxvf gccount.tar.gz -C gccount
gccount已预编译好，解压后可直接使用。
另外，control-freec需要环境中包含（或配置文件中指定路径）R、samtools、bedtools、sambamba等。其中samtools和sambamba用于处理bam文件，bedtools用于生成minipileup格式文件。
如果需要结果中包含比对信息，需下载mappability track，官方提供hg19、hg38、mm9、mm10等基因组的track。
如果需要检测等位染色体状态，需下载dbsnp文件，官方提供了hg19、hg18、mm10等，不知道和ncbi提供的dbsnp格式是否存在差异。
使用
Control-Freec的使用命令非常简单
freec -conf conf.txt
重要的是配置文件，软件源码库中包含了WES和WGS等两个例子。但是，例子是的内容是相当不全的，更多的配置标签需要看官网的教程。
以下是WGS例子，我增加了输出路径等及删除了部分用不上的参数。
[general]
outputDir = /path/to/output
chrLenFile = b37.freec.len
ploidy = 2
breakPointThreshold = .8
#coefficientOfVariation = 0.01
window = 50000
#step=10000
chrFiles = /path/to/b37/sep_chrom
GCcontentProfile = /path/to/b37/b37.freec.50kb.gc.cnp
maxThreads = 8
#readCountThreshold=10
#numberOfProcesses = 4
#outputDir = test
#contaminationAdjustment = TRUE
#contamination = 0.4
#minMappabilityPerWindow = 0.95
#breakPointType = 4
#forceGCcontentNormalization = 0
sex=XY
#BedGraphOutput=TRUE
sambamba = sambamba
SambambaThreads = 8
[sample]
mateFile = test.bam
#mateCopyNumberFile = test/sample.cpn
inputFormat = BAM
mateOrientation = 0
##use "mateOrientation=0" for sorted .SAM and .BAM
[control]
#mateFile = /path/control.pileup.gz
#mateCopyNumberFile = path/control.cpn
#inputFormat = pileup
#mateOrientation = RF
#[BAF]
##use the following options to calculate B allele frequency profiles and genotype status. This option can only be used if "inputFormat=pileup"
#SNPfile = /bioinfo/users/vboeva/Desktop/annotations/hg19_snp131.SingleDiNucl.1based.txt
#minimalCoveragePerPosition = 5
##use "minimalQualityPerPosition" and "shiftInQuality" to consider only high quality position in calculation of allelic frequencies (this option significantly slows down reading of .pileup)
#minimalQualityPerPosition = 5
#shiftInQuality = 33
[target]
##use a tab-delimited .BED file to specify capture regions (control dataset is needed to use this option):
#captureRegions = /bioinfo/users/vboeva/Desktop/testChr19/capture.bed
后面的target标签应该是做靶向捕获数据或者只想分析某个区域数据时才需要的，而BAF标签则是需要分析LOH等内容时才需要。要进行BAF分析时，输入文件格式必须时pileup而不是bam。
general标签中的chrLenFile需要的是染色体的长度，可以直接使用samtools faidx 生成的fai索引（未测试），官网也提供了hg19的这个文件。如果是使用GATK的b37参考基因组，则把chr去掉即可。
chrFiles需要填的是fasta格式文件的路径，建议是该路径下仅包含reference的各个染色体的fasta文件，不要包含其他基因组的fasta文件，命名要与chrLenFile中的染色体名相同。如chr1.fa、chr2.fa等。
可以使用samtools对参考基因组进行提取，把每个染色体拆分出来
samtools faidx hg19.fa chr1 > seq_chrom/chr1.fa
GCcontentProfile则是需要划分的每个bin的GC比例用于校正，获得的方法是使用gccount软件，conf.txt文件与freec的用同一个即可。
gccount -conf conf.txt
后续分析
软件的速度还是比较快的，上述分析完成后，会生成后缀为_CNVs、_ratio.txt、_sample.cpn、_info.txt等文件。结果在CNVs文件中。
再使用assess_significance.R脚本补充p值，这个脚本需要安装R包“rtracklayer”
cat FREEC-11.6/scripts/assess_significance.R | R --slave --args test.bam_CNVs test.bam_ratio.txt
可使用makeGraph.R画图
cat FREEC-11.6/scripts/makeGraph.R | R --slave --args 2 test.bam_ratio.txt
将ratio文件转为bed格式或circos格式
perl FREEC-11.6/scripts/freec2bed.pl -f test.bam_ratio.txt > test.bam_ratio.bed
perl FREEC-11.6/scripts/freec2circos.pl -f test.bam_ratio.txt > test.bam_ratio.circos