扩增子(2)：phyloseq画图

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phyloseq是一个很好的用来对扩增子流程处理处理的OTU等数据，进行后续分析画图的包。 支持的上游软件包括了DADA2, UPARSE, QIIME, mothur, BIOM, PyroTagger, RDP。

首先在R中安装。

source("https://bioconductor.org/biocLite.R")
biocLite("phyloseq")

回过头来，上次说到的DADA2处理的数据。 实际上，其中的seqtab.nochim就是后续需要的otumat也就是OTU表格。 而taxa则是taxmat也就是taxa表格。

这些在phyloseq的文档里说的比较清晰。

otumat 上图就是一个otu表格。 每个otu是一段特征序列，如果是在16S中，就是16S序列。然后表格的意思是：每个样本中，不同的otu检测的reads数，当然这个数值是校正之后得到的。

taxmat 这个是taxa表。 是用otu和参考数据库进行过比对，来说明每个otu属于什么品种。上面的列名就是界门纲目科属种。

先来把上次的结果导出。

write.csv(seqtab.nochim, "~/workspace/AMP/OTU/otumat.csv", quote=FALSE)
write.csv(taxa, "~/workspace/AMP/OTU/taxmat.csv", quote=FALSE)

然后开始画图的步骤。

引入包和主题

library(phyloseq)
library(ggplot2)
theme_set(theme_bw())

# 导入数据
otumat <- read.csv("~/workspace/AMP/OTU/otumax.csv", header=TRUE, quote="", row.names=1)
taxmat <- read.csv("~/workspace/AMP/OTU/taxmat.csv", header=TRUE, quote="", row.names=1)
# 转换为矩阵
otumat <- as.matrix(otumat)
taxmat <- as.matrix(taxmat)
# 读为otu和tax
# 这里由于DADA2输出的文件，样本名是行名（第一列），所以参数设置是FALSE。如果样本名是列名，则设置为TRUE
# 实际上，也可以直接默认TRUE，然后利用otu <- t(otu)这样改过来
otu <- otu_table(otumat, taxa_are_rows=FALSE)
tax <- tax_table(taxmat)

建立otu与tax的联系

physeq = phyloseq(otu, tax)

画物种丰度图

# 可以选择界门纲目科属种来画。
plot_bar(physeq, fill="Domain")
plot_bar(physeq, fill="Phylum")
plot_bar(physeq, fill="Class")
plot_bar(physeq, fill="Order")
plot_bar(physeq, fill="Family")
plot_bar(physeq, fill="Genus")
plot_bar(physeq, fill="Species")

bar 上图为门的丰度图，容易看出属于Bacteroidetes门的丰度最高。

Alpha分析

# 可以把Shannon指数和Simpson指数分开画，也可以一起画
plot_richness(physeq, measures="Shannon")
plot_richness(physeq, measures="Simpson")
plot_richness(physeq, measures=c("Shannon", "Simpson"))

alpha 其中，Shanno指数越大，说明菌群多样性越高；Simpson指数越小，说明菌群多样性越高。 hmmm，总觉得这里很怪。 另外，实际上应该把样本按时间排列，比较好观察。 实际操作的时候应该需要引入一个样本的状态的变量。

Beta分析

physeq.pop <- transform_sample_counts(physeq, function(otu) otu/sum(otu))
ord.nmds.bray <- ordinate(physeq.pop, method="NMDS", distance="bray")
plot_ordination(physeq.pop, ord.nmds.bray, title="Bray NMDS")

beta PCA、PCoA还有NMDS图都是分析组件差异的。必须有多个样本才有意义。 上图里，明显的分出了至少两个组（左边、右边）。如果加入了时间变量，会发现就是两个不同时间段（测试的样本就是不同时间检测的样本）。