家系分析

可以同时对一整个家系的所有样本进行分析，评估相关的致病位点。家系分析需要先证者（proband）和父母的样本数据。

PED文件

PED文件描述了家系的成员关系，是很多工具的标准输入格式。格式为6列制表符分隔：

FamilyID    IndividualID    PaternalID    MaternalID    Sex    Phenotype
FAM001    proband    father    mother    1    2
FAM001    father    0    0    1    1
FAM001    mother    0    0    2    1

各列含义：

FamilyID：家系标识
IndividualID：个体标识
PaternalID：父亲ID（无则填0）
MaternalID：母亲ID（无则填0）
Sex：性别（1=男，2=女，0=未知）
Phenotype：表型（1=正常，2=患病，0=未知）

注意：IndividualID必须与VCF/BAM中的样本名完全一致。

亲缘关系鉴定

在进行家系分析前，需要先验证样本之间的亲缘关系是否正确。使用Peddy进行验证：

peddy \
    -p 16 \
    --sites GRCH38.sites \
    --prefix trio \
    trio.vcf.gz \
    trio.ped

Peddy会进行三项检查：

ped_check：验证家系关系是否与声明一致，通过IBS (Identity By State) 计算
sex_check：验证性别是否与声明一致，通过X染色体杂合率判断
het_check：检查杂合率异常，排查近亲婚配或样本污染

如果亲缘关系验证不通过，需要排查原因后再进行后续分析。

GVCF合并

对于产生自DeepVariant的GVCF文件来说，需要使用GLNexus进行合并。GLNexus在合并的同时完成联合基因分型，这比GATK的CombineGVCFs + GenotypeGVCFs两步流程更高效：

# 将所有样本的gVCF和索引链接到同一目录
mkdir -p inputs_dir
ln -s proband.g.vcf.gz inputs_dir/
ln -s proband.g.vcf.gz.tbi inputs_dir/
ln -s father.g.vcf.gz inputs_dir/
ln -s father.g.vcf.gz.tbi inputs_dir/
ln -s mother.g.vcf.gz inputs_dir/
ln -s mother.g.vcf.gz.tbi inputs_dir/

# 使用GLNexus进行联合基因分型
glnexus_cli \
    --config DeepVariantWES \
    --threads 16 \
    inputs_dir/*.g.vcf.gz > trio.glnexus.bcf

# 转换为VCF.gz并建立索引
bcftools view --threads 16 -O z -o trio.glnexus.vcf.gz trio.glnexus.bcf
bcftools index -t trio.glnexus.vcf.gz

--config DeepVariantWES是专门为DeepVariant WES数据优化的配置，与DeepVariant配合使用效果最佳。

注意：GLNexus的输入必须是DeepVariant或GATK HaplotypeCaller产生的GVCF文件。

单倍型定相

在联合基因分型后，使用先证者的BAM文件进行read-backed单倍型定相。这有助于确认从父母遗传的变异是否位于同一条染色体上：

whatshap phase \
    --reference=GRCh38.d1.vd1.fa \
    -o trio.phase.vcf \
    trio.glnexus.vcf.gz \
    bam/proband.markdup.bam

bgzip -f trio.phase.vcf
tabix -f -p vcf trio.phase.vcf.gz

左对齐和过滤

与单样本流程一致，进行左对齐和过滤：

gatk LeftAlignAndTrimVariants \
    -R GRCh38.d1.vd1.fa \
    -V trio.phase.vcf.gz \
    -O trio.left.vcf.gz \
    --split-multi-allelics

bcftools view -f 'PASS,.' trio.left.vcf.gz -Oz -o trio.final.vcf.gz
bcftools index -t trio.final.vcf.gz

家系变异分析

使用VEP对联合分型后的VCF进行注释，然后生成报告。报告会自动处理多个样本的基因型信息：

# VEP注释（与单样本流程相同）
vep \
    --offline --cache \
    --dir_cache cache_dir --merged \
    --dir_plugins /opt/vep/.vep/Plugins \
    -i trio.final.vcf.gz -o trio.vep.vcf \
    --format vcf --vcf \
    --fa GRCh38.d1.vd1.fa \
    --assembly GRCh38 --symbol --hgvs \
    --transcript_filter "stable_id match N[MR]_" \
    --custom file=schema_bundle/hg38_clinvar_20260415.vcf.gz,short_name=ClinVar,format=vcf,type=exact,coords=0,fields=CLNSIG%CLNDN%CLNREVSTAT%CLNSTAR \
    --custom file=schema_bundle/hg38_gnomad.v4.1.filtered.vcf.gz,short_name=GnomAD,format=vcf,type=exact,coords=0,fields=AC_joint%AN_joint%AF_joint%AF_joint_eas

# 生成报告
python3 vep_report.py \
    -i trio.vep.vcf.gz \
    -o report/trio.snv_indel.txt \
    --gencc assets/gencc-submissions.xlsx \
    -t assets/transcripts.json \
    --sex male \
    -n proband,father,mother

报告会显示每个变异在三个样本中的基因型，便于判断遗传模式（如de novo突变、复合杂合、纯合等）。

UPD检测

在获得家系数据后，可以检测UPD (单亲二倍体)。原理是比较先证者的ROH区域与父母的ROH模式：

# 对每个样本分别检测ROH
bash AutoMap_v1.3.sh --vcf proband.vcf --genome hg38 --out roh/proband --id proband
bash AutoMap_v1.3.sh --vcf father.vcf --genome hg38 --out roh/father --id father
bash AutoMap_v1.3.sh --vcf mother.vcf --genome hg38 --out roh/mother --id mother

# 生成ROH报告
python3 roh_report.py -i roh/proband/proband.HomRegions.tsv -o report/proband.roh.anno.txt -g assets/gencc-submissions.xlsx -b assets/Gencode.GRCh38.cnvkit.target.bed
python3 roh_report.py -i roh/father/father.HomRegions.tsv -o report/father.roh.anno.txt -g assets/gencc-submissions.xlsx -b assets/Gencode.GRCh38.cnvkit.target.bed
python3 roh_report.py -i roh/mother/mother.HomRegions.tsv -o report/mother.roh.anno.txt -g assets/gencc-submissions.xlsx -b assets/Gencode.GRCh38.cnvkit.target.bed

# UPD检测
python3 upd_detection.py \
    -p report/proband.roh.anno.txt \
    -f report/father.roh.anno.txt \
    -m report/mother.roh.anno.txt \
    -o report/trio.upd_report.txt

如果先证者的某个ROH区域与父亲的ROH重叠但与母亲不重叠，则该区域可能为父源UPD；反之为母源UPD。