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比对

比对是生物信息分析最常用的方法，就是把自己的数据拿去跟参考数据进行比较，得到差异的结果。而当所要分析的数据是变异时，差异的结果就是突变的碱基，也可以说是突变的基因。在DNA-seq中，常用的比对软件是bwa。另外还有bowtie2，但是bowtie2似乎在RNA-seq的比对中比bwa好，而在DNA中要稍微弱一些。除此之外，还有华大的soup，速度很快的subread等。

这里着重讲bwa。

比对之前

比对之前，当然是先要做一下质控。经典方法是使用fastqc进行质控报告的生成 

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fastqc Illumina_B17NC_R1.fq.gz Illumina_B17NC_R2.fq.gz

从fastqc的结果看，这个样本的质量非常高（毕竟是卫生部生成出来做质量检测的），所以并不需要做进一步的过滤。但是这里也说一下怎么用fastp进行简单的过滤。 然后用cutadapt来剪掉adapter序列。目前的话，国产软件fastp也不错，可以自动完成上面的操作，同时下游的multiqc软件都支持fastqc以及fastp。 

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fastp -i Illumina_B17NC_R1.fq.gz \
    -I Illumina_B17NC_R2.fq.gz \
    -o B17NC.clean_R1.fq.gz \
    -O B17NC.clean_R2.fq.gz \
    -w 8 -j B17NC.json -h B17NC.html

建立索引

推荐使用bwa进行比对。 bwa的下载与安装都很简单，虽然可以通过conda等软件安装，但是我觉得这样装软件没有灵魂，尤其是bwa这种常用的软件，还是直接装比较好。后面应该都不会介绍软件的安装了，这是一个基于google的基本技能。 

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wget https://github.com/lh3/bwa/releases/download/v0.7.17/bwa-0.7.17.tar.bz2
tar -zxvf bwa-0.7.17.tar.bz2
cd bwa-0.7.17
make
我是十分建议把常用的软件加入环境变量的。 bwa和bowtie2都是用一种叫bwt的算法进行比对。在比对前，需要先创建索引，提高整个比对速度。 用bwa对参考基因建立索引 
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bwa index Homo_sapiens_assembly38.fasta
还要建立fasta的索引。 
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samtools faidx Homo_sapiens_assembly38.fasta
gatk CreateSequenceDictionary -R Homo_sapiens_assembly38.fasta

比对

使用bwa mem进行比对。 

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bwa mem -t 8 Homo_sapiens_assembly38.fasta \
    Illumina_B17NC_R1.fq.gz \
    Illumina_B17NC_R2.fq.gz \
    -R "@RG\tSM:B17NC\tID:B17NC\tPL:illumina\tPU:NCCL" \
    > B17NC.sam

这样，就比对出了sam文件，sam文件的格式我觉得也是需要好好学习的。非常建议加入-R参数指定头信息，这样后面我们用GATK就不需要使用AddOrReplaceReadGroups来改了。